| PGX-CYP2C19StripAssay® |  | 4-750 |
1. Lysis Solution 50 ml
2. GENXTRACT Resin 5 ml
Resuspend each time immediately before removing an aliquot.
3. Amplification Mix (yellow cap) 500 µl
4. Taq Dilution Buffer (transparent cap) 500 µl
5. DNAT (blue cap) 1.5 ml R 36/38
6. Typing Trays 3
7. Teststrips 20
8. Hybridization Buffer (white cap) 25 ml
9. Wash Solution A (white cap) 80 ml
10. Conjugate Solution 25 ml
11. Wash Solution B 80 ml
12. Color Developer 25 ml
使用說明
一、預期用途
基于聚合酶的細胞色素（cyp）2c19基因突變檢測
鏈式反應和反向雜交。
二。方法
這個過程包括三個步驟：（1）DNA分離，（2）生物素化PCR擴增
引物，（3）擴增產物與含有等位基因特異性的試紙條雜交
寡核苷酸探針固定成平行線陣列（圖1）。結合生物素
用鏈霉親和素堿性磷酸酶和彩色底物檢測序列。
該方法包括8個多態位點：c.681g>a（2c19*2），c.636g>a（2c19*3），c.1a>g。
（2c19*4），c.1297c>t（2c19*5），c.395g>a（2c19*6），c.819+2t>a（2c19*7），c.358t>c
（2C19*8），C.-806C>T（2C19*17）。
更多的遺傳信息可在OMIM在線孟德爾人類遺傳：
www.ncbi.nlm.nih.gov/omim
三、套件組件
見一頁所有組件清單。
脫氧核糖核酸含1.6%氫氧化鈉（r 36/38）。
放大混合物，TAQ稀釋緩沖液，共軛溶液，洗滌液B含0.05%
奶奶3。結合液中含有鏈霉親和素堿性磷酸酶。彩色顯影劑
含有硝基藍四唑（NBT）和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP）。
不使用時，將所有試劑儲存在2-8°C！
四、需要但未提供的材料
除了標準分子生物學實驗室設備外，還需要以下設備：
•可調微型離心機，轉速3000-12000轉/分（1000-12000 x g）
•培養箱（例如加熱塊、水浴），溫度分別為56°C和98°C（±2°C）
•熱循環器和合適的薄壁塑料反應管/帶
•TAQ DNA聚合酶
•帶振動臺和可調溫度的水浴槽（45°C±0.5°C）
•真空抽吸裝置
•振動篩（搖桿或軌道振動篩）
•可選：瓊脂糖凝膠電泳設備（用于擴增產物的控制）
分析程序
一。DNA分離
新鮮或冷凍的血液中加入edta或檸檬酸抗凝劑；避免血液中含有肝素。
在室溫下儲存血液的時間不得超過3天，在2-8°C下儲存血液的時間不得超過1周
使用前。冷凍一年以上，或經歷多次
三次以上的凍融循環不適合用于此程序。
把血樣帶到室溫。小心倒置采血管，充分混合
好幾次。每次取血前重復混合。
使裂解液和genxtract樹脂達到室溫。
•用帶螺帽的1.5毫升微管吸取100微升血液樣本。
•加入1毫升裂解液，合上試管，倒置數次混合。
•室溫下靜置15分鐘。
•在微型離心機中以3000轉/分（約1000 x g）離心5分鐘。
•取下并丟棄上層（頂部）1毫升上清液。
•加入1毫升裂解液，合上試管，倒置數次混合。
•在微型離心機中以12000轉/分（約12000 x g）離心5分鐘。
•除去并丟棄上清液，但約50微升可見的軟顆粒除外。
•*旋轉瓶子，重新使用Genxtract樹脂。
•向顆粒中添加200微升Genxtract樹脂。關閉管和渦流10秒。
樹脂沉積迅速。每次立即重復再懸浮
在移除另一個等份之前。
•在56°C下孵育20分鐘，渦流10秒。
•在98°C下孵育10分鐘，渦流10秒。
•在微型離心機中以12000轉/分離心5分鐘。冰上涼快。
所得到的上清液含有適于在pcr中立即使用的dna模板。為了
進一步儲存時，上清液應轉移到新鮮的試管中并保持冷藏。
（2-8°C；多一周）或冷凍在-20°C。
2.體外擴增（PCR）
將所有PCR試劑和DNA模板冷藏。執行所有步驟直到開始
冰上熱循環程序（0-4°C）。
•在TAQ稀釋緩沖液中制備新的TAQ DNA聚合酶工作稀釋液（0.2 U/微升）
（透明蓋）。
•為每個待放大的樣品準備一個反應管。把管子放在冰上。
•對于每個樣品，在冰上制備終PCR反應混合物：
15微升放大混合物（黃蓋）
5微升稀釋TAQ DNA聚合酶（1U）
5微升DNA模板
如果使用的DNA模板不是由試劑盒分離協議（第V/1章）制備的，則
建議濃度范圍為5-40微克/毫升（=每個反應25-200納克DNA）。
把管子蓋緊。將熱循環器預熱至94°C。
•插入反應管并運行以下熱循環程序：
預PCR:94°C/2分鐘。
熱循環：94°C/15秒。-58攝氏度/30秒。-72攝氏度/30秒。（35個循環）
終延伸：72°C/3分鐘。
將放大產品存放在冰上或2-8°C下，以備進一步使用。
可選：用凝膠電泳分析擴增產物（如3%瓊脂糖凝膠）。
片段長度：288254218182161146bp
三。雜交（45°C；振蕩水浴）
將水盆的水位調整到打字托盤高度的約1/2。
將水浴加熱至45°C（±0.5°C）。用校準過的
溫度計。
預熱雜交緩沖液并將溶液A洗滌至45℃（注意所有沉淀
在2-8°C下形成，*溶解。）
使試紙、DNAT、共軛溶液、洗滌溶液B和顯色劑達到
室溫。準備打字托盤。
使用干凈的鑷子為每個樣品取下一個測試條。（用手套觸摸測試條
只有！）用鉛筆在標記線外標記測試條。（沒有圓珠筆，馬克筆，
等）
•將10微升DNAT（藍帽）吸管插入每個通道的下角，用于打字
托盤（每個樣品一條通道）。
•將10微升擴增產物加入相應的DNA滴中。
用吸管*混合。（解決方案將保持藍色。）
•室溫下靜置5分鐘。
•在每個通道中加入1毫升雜交緩沖液（預熱至45°C）。
輕輕攪動托盤。（藍色將消失。）
•插入帶有標記的測試條（可見線條！）進入各自的車道。潛入
*。
•在水浴的搖床上，在45°C下培養30分鐘。
設置適當的震動頻率（約50轉/分）以避免溢出。保持
水盆關閉以避免溫度變化。
•孵化結束時，通過真空抽吸去除雜交溶液。
立即進行。在整個過程中，不要讓測試條干運行。
四。嚴格清洗（45°C；搖晃水浴）
•加入1毫升洗滌液A（預熱至45°C）。短暫沖洗（10秒）。
通過真空抽吸除去液體。
•加入1毫升洗滌液A（45°C）。
•在45°C的搖動水浴中培養15分鐘。
通過真空抽吸除去液體。
•加入1毫升洗滌液A（45°C）。
•在45°C的搖動水浴中培養15分鐘。
通過真空抽吸除去液體。
5個。顯色（室溫）
•加入1毫升共軛溶液。
•室溫下在搖床或軌道振動篩上培養15分鐘。
通過真空抽吸除去液體。
•加入1毫升洗滌液B。短暫沖洗（10秒）。
通過真空抽吸除去液體。
•加入1毫升洗滌液B。
•室溫下在搖床或軌道振動篩上培養5分鐘。
通過真空抽吸除去液體。
•加入1毫升洗滌液B。
•室溫下在搖床或軌道振動篩上培養5分鐘。
通過真空抽吸除去液體。
•加入1毫升顯色劑。
•在室溫下，在搖床或軌道振動篩上黑暗中培養15分鐘。
陽性反應出現紫色染色。
•用蒸餾水清洗測試條數次。
在暗處用吸水紙把紙條晾干。
顏色顯影后，不要將試紙置于強光下。
六、結果解釋
樣本的基因型是用所附的collectorTM表確定的。
將處理過的測試條放入字段之一，將其與示意圖對齊
使用紅色標記線（頂部）和綠色標記線（底部）繪制，并用
膠帶。
上面控制線的正反應表示共軛的正確函數
溶液和顯色劑。這條線應該總是染色陽性。
對于每個多態性位置，應獲得以下染色模式之一：
注意：陽性線的染色強度可能不同。這對結果沒有意義。
